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Transfert

Protocoles

Extraction et quantification d’ADN du sol

L’objectif de ce mode opératoire est d’extraire l’ADN génomique total à partir de 1 g de sol équivalent sec (lyophilisé) grâce à une lyse mécanique couplée à une lyse chimique. La lyse est mécanique est réalisée par broyage mécanique dans un broyeur en présence de billes et la lyse chimique se fait en présence d’un tampon d’extraction contenant les produits suivants : de l’EDTA qui permet de chélater la majorité des cations bivalents (Mg2+) et cofacteur de nombreuses DNAses; du Tris pH 8,0 qui tamponne la solution, du NaCl qui limite les dénaturations partielles possibles de l'ADN à 70°C et libère de nombreuses interactions ADN - protéines; et le SDS qui facilite la lyse des membranes et la dénaturation des protéines. Pour séparer l'ADN des protéines dénaturées, la déprotéinisation consiste à précipiter les protéines en présence d'une forte concentration en sel. Cette méthode présente deux avantages : les interactions ADN - protéines sont bien détruites et les produits ne sont pas toxiques (contrairement aux solvants organiques, phénol et chloroforme). Les précipités sont séparés par centrifugation à haute vitesse. Le surnageant limpide contient les ADNs. Une précipitation à l’isopropanol et un lavage à l’éthanol permet d’éliminer de récupérer un ADN dit brut c'est-à-dire contenant encore des éléments polluants (protéines, sucres, macromolécules phénoliques, acides humiques…).

Mesure de la Biomasse Moléculaire Microbienne du sol

La méthode de mesure de la Biomasse Moléculaire Microbienne repose sur la quantification de l’ADN microbien extrait directement à partir de l’échantillon de sol. Le protocole d’extraction est une optimisation du protocole d’extraction normalisé ISO 11063 à partir d’1 gramme de sol, permettant une amélioration de l’extraction des ADN des communautés de champignons notamment.

Purification de l’ADN du sol en vue de sa caractérisation

L’objectif est de purifier des ADN sales après extraction d’ADN de sol, de boues ou de sédiments. La purification se fait en deux étapes, un tamis moléculaire réalisé sur colonne NucleoSpin Inhibitor Removal Column et une affinité exclusion sur colonne contenant une membrane de silice, NucleoSpin Soil Column.

Analyse de la Diversité des Bactéries et des Champignons : Pyroséquençage des gênes ribosomiques

La caractérisation de la diversité des communautés de bactéries et de champignons est appréhendée par pyroséquençage des gênes ribosomiques (ADNr-16S et ADNr-18S respectivement) de ces organismes. Le pyroséquençage est une technique de séquençage haut-débit qui permet de produire jusqu’à 1 million de séquences par run d’analyse avec la technologie 454 GS-FLX et donc de réaliser un inventaire taxonomique des organismes présents. Le protocole développé par la plateforme GenoSol permet la préparation, par PCR, des banques de gênes pour leur séquençage. Il est optimisé pour le séquençage de plusieurs échantillons par multiplexage (ajout de tag MID).

Mesure de la Densité des Bactéries et des Champignons : PCR quantitative des gênes ribosomiques

La méthode de mesure de la densité (nombre d’individus) des bactéries et des champignons est basée sur le dénombrement des gênes ribosomiques spécifiques des ces communautés. Ce dénombrement est réalisé par PCR en temps réel en utilisant des couples d’amorces universelles des bactéries (ADNr-16S) d’une part et des champignons (ADNr-18S) d’autre part.